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凝胶过滤介质_离子交换介质_亲和层析介质-武汉汇研生物科技有限公司

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                                                                                       填料基本知识方面

序号

 客户问题

汇研答案

 1

 为什么纯化时目标物不与介质结合,或结合量较低?

1.上样量过载,降低上样量,2.上样速度过快,降低上样流速,3.蛋白或脂类在介质中聚集,及时有效地清洗介质或更换新的介质,4.目标物不带电或与介质带同样的电荷,筛选合适的结合缓冲液,5.样本或平衡液中盐浓度和pH不正确,检查样品和平衡液中的电导和pH,6.选用了错误的缓冲液,参考缓冲液选择表,7.样品中加入了不合适的去污剂,检查样品中是否有不合适的去污剂

 2

 洗脱时没有收集到目标物,或只收集到少量目标物,怎么办?

1.目标物没有与介质结合或结合量较少,先确认目标物是否与介质结合,2.洗脱条件不合适,洗脱液洗脱能力不够,加大盐浓度和调整洗脱液pH,3.洗脱时间不够,降低流速,延长洗脱液的保留时间,4.洗脱体积过小,加大洗脱体积,5.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀,检测目标物在洗脱液条件(盐浓度和pH)下的溶解度和稳定性。

 3

 目标物纯度较低怎么办?

1.样品没有经过前处理,样品上柱前必须要经过离心或过滤,2.样品粘度过高,用平衡液适当的稀释样品,降低粘度,3.洗杂不彻底,加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致,4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀,及时有效地清洗介质,5.洗脱条件不佳,优化洗脱条件,6.目标物出现降解,检测目标物的稳定性,7.柱料装填效果不佳,重新装填或购买,8.分离柱顶部有较大储样体积,重新装柱或降低储样体积,9.介质中有微生物生长,介质使用完后,请及时正确保存介质

 4

 哪些因素会引起介质载量下降?

1.上样速度过快,降低上样流速,2.蛋白或脂类在介质中聚集,导致载量下降,及时清洗介质,3.使用次数过多,配基被氧化或脱落,及时清洗介质或更换新介质

 5

 什么原因会造成色谱峰上升缓慢?

介质装填太松,重新装柱

 6

 什么原因会引起色谱峰拖尾?

介质装填太松,重新装柱

 7

 引起柱床有裂缝或干涸的原因有哪些?

出现泄露或大体积气泡引入,检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱

 8

  液流较慢,怎么办?

1.蛋白或脂类聚集,及时清洗介质或滤膜,2.蛋白沉淀在介质中,调整平衡液和洗脱液组分,以维持目标物的稳定性和介质的结合效率,3.分离柱中微生物生长,所用试剂必须经过过滤和脱气;

 9

  柱子管路有气泡,如何处理?

柱管里面没有问题,那是压柱的时候溢出来的。
1.注射器吸满纯化水,将注射器针头插入内管,尝试一下看能不能把气泡赶出来。
2.把填料顶部刻度标记好,连接柱头管路到层析系统,以1ml/min流速开启,同时缓慢松开柱头密封圈,当气泡排尽后,重新压柱。
3.重装。
上述操作都需要测柱效合格后才能使用

10

  客户反映柱底分布器有漏液情况,怎么处理?

若是新柱底分布器,则检查柱底分布器筛板和柱内套杆是否有松动;若不是,则检查是否有密封圈老化的可能。最后检查筛网是否有破损

 11

  Bio-Gel P-100填料,16/70装柱,柱高50-60cm,流速0.2ml/min下,下出口收集液有胶的存在

该款填料耐压较低,不适合装得较高,后换用16/20的柱子,装柱高度在13cm,流速0.12ml/min压柱,控制压力在0.1MPa以内,没有漏胶情况出现。

 12

  装柱有什么要求?Ni柱装柱高度?CHAPS是什么?

将填料搅拌均匀,装的时候将填料压紧,要保证里面没有气泡。Ni柱装柱高度一般是20-30cm,最好不要超过50cm。CHAPS是两性离子非变性去垢剂。

 13

  5ml预装柱直径及高度是多少?

空柱5ml直径17mm. 高37mm,空柱1ml直径8mm.高37mm

 14

 p100装填16/70的柱子存在漏胶问题,怎么处理?

对于p100装16/70柱的项目,我们装柱过程中发现胶面始终不稳定,有往下降,流出液中有胶,用的新柱子,分布器滤膜也未出现异常情况,从以上情况判断,16/70柱不适合装p100填料。

 15

 某蛋白分子量约800kda,用Q柱纯化能否挂柱?

离子柱,调节好PH值都能挂柱。只是分子量大的蛋白,空间结构复杂的蛋白,载量会相应的变低。但不影响正常的挂柱洗脱

 16

 5ml预装柱,用的时候上顶盖喷出来了,该怎么办?

这种情况是由于反压过大造成的。5ml预装柱的材料耐压0.5MPa,但是一般压力超过0.15就可能出现这种情况。建议客户重新装柱后减小流速或者稀释样品再上样。




                                                                                        填料应用方面

序号

客户问题

汇研答案

 1

 目的蛋白6OKD,杂蛋白大于120KD,如何选择分子筛填料?

建议选择200PG,用16/70的柱子。

 2

 用来分离纤维低聚糖单体你们哪款单体比较合适啊?

这个属于小分子分离纯化了,硬胶更适合一些,聚丙烯酰胺凝胶柱。我们的产品推荐用阳离子交换填料试一下。

 3

 像我们1cm*20cm的柱子大概需要多少Sephadex  G-25填料呀?

3.14×0.5×0.5×20=15.7ml  我们的G25是干粉,溶胀系数4-6倍,按照这个比例,只需要3-5g就够了   

 4

 分离多肽比较常用的是哪些产品呀?

我们这边有客户走到生产级别的,用的是SP和MMC。

 5

 目的蛋白和杂蛋白分子量都是50-500kd要怎么选啊?

如果杂蛋白和目的蛋白分子量相差不大,那么分子筛产品是无法分离的,可以选择亲和,离子交换或者疏水填料。

 6

 赛默飞有款Pierce Zeba快速脱盐产品,你们的填料能这么用吗?

我们的用不了。赛默飞这款相当于超滤离心管。通过离心对蛋白溶液进行置换,以达到脱盐换液的目的。我们的如果这样操作,填料会流干,蛋白浓度就会很大,蛋白析出或者变性都有可能。而且该操作可能把填料的孔都堵住,所以不能这么操作。

 7

 咨询脱盐柱G25填料?

建议推荐30pg,G25分子筛干粉,分离范围是1k-5k,葡聚糖聚合是第一代分子筛,试用前要煮沸成湿胶状态。而30pg是湿胶状态,分离范围是可以,葡聚糖和纤维素具有一定的刚性,属于第二代分子筛。可以尝试,

 8

 螯合好的镍柱填料有哪些及其使用范围?

镍柱有三款填料,IDA、IMAC、TED,具体内容请参看最新产品手册第26-27页,一般推荐是常规粒径的.

 9

 请问硬胶和软胶有什么区别?

硬胶主要是耐压比较大,效率高一些,但纯化过程对生物活性影响比较大,非特异性吸附,而软胶反压较小,可保持生物活性。

 10

 一般用离子填料耐高压,有没有合适的填料能够替换GE的30Q啊?

小分子核甘酸纯化耐压大概5bar等,推荐我们的Q-HPR能对标进口,这款填料平均粒径是37μm,耐压是5bar,可以尝试。

 11

 之前购买预活化NHS偶联效果不太好有没有其他合适的填料推荐?

一般推荐客户使用CNBr填料,主要CNBr和NHS偶联的官能团是氨基,但前者偶联量更大一些,效果也更好一些。

 12

 工艺开发的时候样品在高盐条件下选择疏水填料,或者  阳离子填料尝试,但效果不太好怎么办?

可以尝试多模式层析填料摸索合适的洗脱条件。

 13

 小鼠IgM用NHS这个填料偶联蛋白的比例是多少呀?

分子量越大的偶联量越低,建议1-3mg(IgM)/ml(NHS)

 14

 想找一款镍柱填料,之前使用的粒径是FF,容易堵塞孔载量不高?

我们公司可以根据样品的实际情况做定制化填料,建议使用大颗粒填料如Ni-IDA-BB来避免出现堵塞。

 15

 分子筛分离效果不太好是什么原因?

1、目标蛋白和杂质的分子量差异比较小2、装柱高度在60cm,纯化组分分离一般上样量控制在5%以内,组群分离控制在30%。

 16

 亲和镍纯化原核胞外蛋白选择高分辨率,重力柱可以装这款填料吗?

1、重力柱一般选择Ni-IMAC-FF,平均粒径90μm,HP的平均粒径是37μm,小粒径分辨率高,同时反压也比较大,一般重力柱选择90μm的。

 17

 客户之前用了一下我们的Q柱和Ni柱,都出现了填料发红的情况,可以洗掉吗?

填料本身是没有红色的物质,确认一下样品中是否有红色的杂质吸附在微球上,如酚红或色素等。如果是吸附的杂质,可以尝试用高盐清洗一下。如果还不行,可以尝试用8M尿素或者1M氢氧化钠+30%异丙醇清洗。

 18

 DEAE-6FF填料使用过程中,由于样品中有添加低浓度的锰离子,在碱处理过程中填料颜色变黑了怎么办?

1.将填料用1M HCl浸泡处理24h,然后用纯化水洗胶至接近中性,但检测结果显示离子载量合格,但蛋白载量仅为合格载量的50%;2.为预防填料变黑,可在2M NaCl处理过后,用纯化水冲洗柱子10个柱体积以上,再用0.5M NaOH处理。

 19

我们的30PG和75PG产品一般都能做多少次?

没有具体验证过,分子筛和离子交换产品,理论上是可以使用300-500次,实际上是200次左右,亲和填料,理论使用次数是150-200次,实际上100次左右。具体使用次数主要还是看样品清洁度和使用者的习惯及填料保养及清洗状态。

 20

 什么是嗜硫吸附?Plasmid对闭环DNA是嗜硫吸附吗?为什么该填料对开环DNA不吸附?

很多个碱基组成DNA链,链与链之间通过二硫键结合。我们这个Plasmid填料就是作用在二硫键上的。开环DNA的二硫键被打开了,所以填料Plasmid不能吸附开环DNA。

 21

 怎样去除样品中的色素?

1.30PG脱盐柱处理。2.Q柱,结合模式。3.SP柱,流穿模式。

 22

 直径450的,柱高28cm 可以做G25脱盐柱吗?上样量呢?

可以做脱盐柱,不过建议不要装太高,装太高了流速会很慢,建议不超过20cm。上样量研发阶段30%,生产级别20-25%。

 23

 1.请问EAH的15个原子间隔臂是peg形式的还是烷基? 2.请问NHS填料用普通异丙醇保存就可以了吗?3.G75 和75PG这两个性质有什么差异吗?

1.亲水链。2.没用过的可以。3.G75原材料是葡聚糖,75PG原材料是琼脂糖+葡聚糖+纤维素

 24

 1.溴化氢填料时间长了,结合抗原能力下降?2.蛋白液中含有尿素,对填料的偶联影响有多大?3.4FF的孔径是多少?

1.6个月后载量会降低30%-40%。2.确保偶联时的 pH 和盐浓度与 B 液一致:0.2M NaHCO3、0.5 M NaCl,调节 pH 8.3(如果要偶联的生物分子为 IgG 时,pH=8.5-9.0),室温保存。3.数字4和6代表含糖量,含糖量越低,孔径越大,4FF,4BB,孔径是80nm左右,6FF,6BB,孔径是50nm左右。

 25

 抗菌肽纯化,等电点是11.17,求推荐合适的纯化方案?

等电点大于6,基本是选择阳离子填料,阳离子填料上带负电荷。层析填料分为四大类,凝胶过滤,离子交换,亲和,疏水。
亲和的不适合您的项目,成本太高。
凝胶过滤,一般是实在没有别的层析纯化方案,才会选择这一种,优势是纯度和收率比较高,劣势也很明显,上样量只有5%,而且装柱高度有明确的要求,放大生产的时候,需要选择更高配置的层析设备。
就只剩下离子交换和疏水层析了。

 26

 Ni柱是每次用完后都要清洗再生吗?(上样后,淋洗的时候,5ml/min的流速,柱压在0.22)

最好是每次洗脱结束后都重新再生一次,如果样品比较干净,3-5次后,再挂镍重生也可以。如果不再生,洗脱后用纯水洗,然后再过平衡液,再用20%乙醇保存。如果到了生产级别,建议每使用一次,都清洗,可以增加填料的寿命。

 27

 Tris、EDTA和硫酸铵对Q Focurose HPR有影响吗?过柱洗脱的样品凝固了怎么办,样品中有硫酸铵,洗脱液有1M氯化钠。

Tris和EDTA影响不用考虑,硫酸铵需要考虑浓度和pH对上样或洗脱的影响。建议降低洗脱液的氯化钠浓度为0.5M,洗脱液下来后马上用不含氯化钠的洗脱液稀释(保证pH与洗脱液一致)。另外,柱子要装成矮胖子而不是细长个,防止因为洗脱过程中局部浓度过大导致蛋白析出。

 28

 MMC挂上不下来,用2M,KCl都洗不下来,有没有别的洗脱方法推荐的,还有MMC上面是什么疏水配基?

MMC上是苯基疏水基团,洗脱液盐浓度范围是0.5M-2M,建议前期缓冲体系或者上样体系调整,让目的蛋白不要跟填料结合太紧。

 29

 客户反映DEAE FF填料使用后经碱处理颜色变黑是什么原因,该怎么处理?

DEAE FF是可以耐酸耐碱的,工作状态下可以耐受pH 2-9,保存的话,短期保存可以耐受pH 2-14,长期保存可以耐受pH 2-12。
经过与客户沟通确认,怀疑是样品中添加的硫酸锰残留,遇到高浓度氢氧根离子所致。
有如下建议方案:
先尝试用pH2-3的HCl或醋酸 以30cm/h的流速处理5CV,观察看颜色是否有变化。

针对该种情况,处理方法可以按以下步骤来:
1、样品洗脱结束后,用纯化水以60cm/h的流速处理5-10CV,清洗掉残留的样品和再生液(平衡液+1M NaCl);
2、用2M NaCl 以60cm/h的流速处理5CV,除去强离子结合的蛋白;
3、继续用纯化水 以60cm/h的流速处理10CV以上;
4、用0.2-0.5M NaOH 以30cm/h的流速处理5CV,除去一些疏水结合蛋白、沉淀物、脂蛋白等;
5、用纯化水 以30cm/h的流速处理至接近中性;
6、最后用20%乙醇 以30cm/h的流速保存
以上过程如果方便,建议反向冲洗。

 30

 重力柱如何使用?

重力柱跟正常的层析相比,原理完全一样,只是没有检测器的配合,所有的收集样品全凭经验。原则上,凝胶过滤三分之一柱体积收集样品,收集2-3倍上样量。其余挂柱的,换洗脱液后1个柱体积开始收集,收2-3个柱体积。

  31

 离子交换条件怎样设定?

阳离子:pH值低于等电点0.5左右,挂柱模式;pH值高于等电点0.5左右,流穿模式。阴离子:pH值高于等电点0.5左右,挂柱模式;pH值低于等电点0.5左右,流穿模式。                            

  32

 蛋白纯化过程中离子填料如何选择?

根据蛋白的等电点,如果蛋白等电点在8左右,采取阳离子挂柱阴离子流穿模式。如果蛋白等电点在6左右,就反过来,采用阴离子挂柱阳离子流穿。挂柱的可以考虑用复合填料MMC或MMA代替。一般都需要用两根柱子,一阴一阳,一个挂柱模式一个流穿模式。

 33

 预活化介质偶联配基时,偶联时间如何确定?

偶联时间要根据实际反应情况跟踪控制。一般以上清液中,待偶联物质浓度不再减小作为偶联完成的根据。拿蛋白来说,即为上清液UV280值不再有明显的降低,即可认为偶联过程已经完成。

 34

 Ni-IDA或者是Ni-IMAC,使用过程中发现填料变成棕褐色是什么原因?

是因为填料上的Ni脱落,并在碱性环境中发生化学反应生成氢氧化镍沉淀所致。一般可以用0.1M的EDTA缓慢冲洗两小时以求复原。

 35

    填料该如何保存?

亲和填料,一般2-8度保存,其余填料,室温阴暗保存。不能冻结。一旦结冰冻结,复融时填料基质有可能会破碎。



                                                                                        样品处理与检测方面

序号

客户问题

汇研答案

 1

 之前用你们汇研的proteinA和G两种试用装对人的血液抗体A进行纯化,用平衡液一冲就全出来了,后面再用洗脱液洗脱的时候不出峰了,上样1ml,缓冲液PB的PH7.4,流速0.5ml/min,储存溶液用的PH7.2的PB,盐浓度用的0.02M,是什么原因导致的?

 出现这种情况可能有这几个原因:1.1ml的样品中对应的抗体浓度大约6.9至7mg/ml的话,人血清中纯化抗体浓度和量较低,洗脱液中抗体浓度低于检测下限,建议人血清样品增加上样倍数至40倍以上(稀释后的上样体积,人血清体积3-5倍) 2.确认一下样品上样前的条件,主要是PH和电导,建议用平衡液稀释10倍以上,复测PH和电导的差异(平衡液稀释后PH和电导差异较小,不用调整)

 2

 我们的样本含有40mM咪唑可以上离子交换柱吗?用的你们汇研的SP,样本含有40mM咪唑,1mMPMSF,1mM-EM,2mMDTT,这个带10个his标签的蛋白超声时得有500mM盐,一定要先透析掉盐再上柱吗?

1 、高盐对于超声破碎的影响比较小,主要是看蛋白的稳定性。所以关注点不是高盐超声破碎,而是上柱的填料对送溶液电导的要求,例如,过SP预装柱,可以低盐超声破碎也可以高盐超声破碎,但是上样前需要检测电导,如果高于10mS/cm,需要对样品缓冲液置换透析或直接加上柱平衡液进行稀释电导至10mS/cm以下。

2、超声后用上清还是沉淀复溶上样,取决于目标物是在上清还是沉淀,初次实验或不确定时,建议上清和下层沉淀分别取样电泳,确定目标物在上清还是沉淀中。
目标物在上清表达是可溶的,在下层沉淀是表达包涵体,需要用尿素或盐酸胍溶解后上样,纯化后复性。

 3

 我们是做DNA聚合酶的表达纯化,目前是用镍柱进行纯化,纯化后纯度很纯,基本只有一条目的蛋白,然后过肝素柱子的目的是想把基因组DNA去除,但是过完肝素柱子除了目的蛋白,还出现了疑似目的蛋白的二聚体,而且只用肝素柱子一步纯化,纯度差,还有一个问题是用肝素柱子的时候好多蛋白不挂柱,你们汇研有这方面的例子吗?我们的目标蛋白是DNA聚合酶,理论上是结合肝素的,这方面优化平衡液和样品填料能实现最终纯化吗?

  肝素是亲和填料,只对特定目标物结合,不是所有蛋白都结合,如果目标物不结合或结合量很少,需要优化平衡液和样品的条件,让样品和填料充分结合。可以的,但是看客户的纯度要求,纯度要求非常高的话还是建议两步或两步以上纯化。

 4

 我们用的杆状病毒表达系统,之前挂柱效果不理想,这次将His标签长度增加到10个了,这种情况推荐哪一款镍柱呀?之前用过GE的填料,普通的那种,也用过你们汇研的耐EDTA的那种预装柱TED。

 TED的载量最低,但是耐EDTA。如果可以用普通的Ni柱,不需要耐EDTA的话,可以用IMAC试试。

 5

 在细胞里扩增病毒,如何能更好的和细胞成分分离开?离心的时候有很多病毒被带到沉淀里


  如果有遇到很多病毒被带到沉淀里,且病毒浓度不大的话,那么可能是在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时,由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在,导致提纯效果不理想。
有看到类似情况的,可以尝试差速离心法。
原理是:不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别,沉降速度差别(相差)在一个或几个数量级的粒子,可用差速离心法分离提取待纯化的病毒。

  简单说,是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。
具体做法是:以差速离心法分离提纯病毒时,经常以低速 (2000~3000r/min,20~30min) 及中速(10000 r/min,20~30min) 去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。然后,选择在60min内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度,离心 1~2h使病毒沉淀。

 6

 DNA聚合酶纯化后,要检测这个基因组DNA残留,该怎么检测?


定性的话就用DNA电泳试试,定量就麻烦些,用同位素法或者做荧光定量pcr。

 7

 G50和G75 这几款葡聚糖配合重力柱试用,需要额外加压吗?

  重力柱不能加压,用重力柱做G75一类的这些东西的拖延或者缓冲液置换,就是算体积的,核心的思想就是你的样品的进去测,你看好柱体积,1/3个柱体积开始收集,就是1/3柱体积开始出峰,理论就是这样子。如果你的柱子是四毫升,那就是3.3毫升,你下面看到过了3.3毫升之后开始收,大概收个几毫升吧,可以首两个至一个体积左右,你上样量大概翻个三倍左右,你上一毫升就收三毫升以上,两毫升就收六毫升,差不多就是这样一个范围,重力柱的话完全就是凭经验做的,没有任何检测就是在线检测的。

 8

 1,将高亲和力的单抗偶联到填料中,纯化样品中的特异性蛋白,请问你们汇研目前有没有做过中试规模的例子可供分享?2.人源化抗体好偶联吗?3.这种偶联填料都装多大的柱子,如果处理样品量比较大,你们能不能做?

 我们有做过纳米抗体偶联的项目,做过几十升中试规模的。您那边方便的可以把抗体寄过来,我们帮您偶联,可能前期要做一个基质微球的筛选。

 9

 猪腹泻全病毒纯化:1.灭活前还是灭活后纯化?2.收率多少,检测方法是什么?3.色素问题?

1.两种方式都有,要根据具体的工艺具体安排。2.两种纯化方案收率不同,要根据自己的产品情况选择。检测方法是客户提供的,不方便透露。3.色素是后洗脱出来的。

 10

 病毒被带到沉淀里怎能办?

 如果有遇到很多病毒被带到沉淀里,且病毒浓度不大的话,那么可能是在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时,由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在,导致提纯效果不理想。
有看到类似情况的,可以尝试差速离心法。具体做法是:以差速离心法分离提纯病毒时,经常以低速 (2000~3000r/min,20~30min) 及中速(10000 r/min,20~30min) 去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。然后,选择在60min内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度,离心 1~2h使病毒沉淀。

 11

 怎样鉴定样品中的二聚体?

 用我们的分子筛填料,分辨率不够很难鉴定出来。建议用HPLC,根据分子量范围选择一根合适的分子筛柱子,在目标蛋白峰前面出的小峰即为二聚体。




                                                                                         装柱方面

   序号

  客户问题

 汇研答案

    1

  

 柱子出现漏液是什么原因? 


 阀门、密封圈没拧紧,管路破损

    2

  

 凝胶出现裂缝是什么原因? 


 气泡进入层析柱,需重装

    3

  

 柱子分辨率降低,分离效果不好是什么原因?


 柱效不合格; 流速过快(30cm/h); 上样量过大(组群分离≤30%、精细分离 ≤0.5

-4.0%); 层析柱使用时间过长,凝胶出现结块需重装

    4

 

 凝胶发黄是什么原因? 


 使用时间过长; 清洗不够彻底 (1M NaOH/2%  Triton X100/20%乙醇/30%异丙醇等清洗)

    5


 峰形图前倾/拖尾是什么情况? 


 前倾(AS<1.0):过紧;拖尾:过松(AS>1.0)

    6

 

  反压过大是什么原因? 


 凝胶堵塞; 层析系统管路/进样头/在线过滤器堵 塞; 装柱过紧; 凝胶破碎;


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