超螺旋质粒DNA的纯化工艺

什么是质粒

质粒DNA含有独立复制的遗传结构，是基因工程的常用工具，广泛应用于分子生物学基础研究、农业转基因检测、医疗诊断与基因治疗等领域。

质粒DNA是一类能在细菌染色体外自主复制的环形双链DNA分子，其构型一般分为超螺旋、开口环状及线性3种。不同类型的质粒DNA分子量大小不同，大的可达105kDa，小的则仅为103kDa左右。

初步纯化的质粒DNA溶液中常混有3种构型，并且掺杂一定量的蛋白质、RNA、内毒素以及宿主基因组DNA，这些杂质会影响后续的应用，因此质粒DNA需要进一步精细纯化。为获得大量高纯度的质粒DNA，常用以下经典三步法进行纯化。用6FF去除RNA，避免应用RNaseA所造成的动物源性酶类污染及需要去除等不便，再应用Plasmid去除开环及线性的质粒DNA，经Q柱精提，获得高纯度质粒DNA。

                                                                                                                   质粒三步法纯化流程图

质粒纯化过程中，体积排阻色谱(Size－exclusion chromatography，SEC)主要用来分离组分中的RNA，该技术基于裂解液中质粒DNA、宿主DNA、RNA以及其他较小分子之间分子量的显著差异，对目标分子分离纯化。填料多为Focurose 6FF，且质粒DNA与RNA的分离效果直接受所用盐溶液类型及其浓度的影响。Stadler等［1］比较了在不同盐溶液类型以及同一盐溶液不同浓度下，质粒DNA与RNA的分离效果，结果显示氯化钠浓度需达到0.5mol/L才能实现质粒DNA与RNA的分离，而2mol/L硫酸铵则为两者分离的最佳浓度。

                                                                                                                     分子筛层析Focurose 6FF图谱

开环质粒DNA与超螺旋DNA分子性质高度类似，开环的产生一般发生在发酵及裂解操作中，为超螺旋DNA一条链的断裂所致，断裂前的状态具有更高的碱基暴露程度和表面电荷。Plasmid填料可以利用独特的嗜硫亲和作用，高效区别这两种形式的细微差别，故可用于质粒不同构型的分离。对于大小和序列不同的质粒，纯化的最佳条件略有区别。

                                                                                                              嗜硫亲和层析Plasmid Focurose HPR图谱

离子交换层析是根据混合物中不同分子所带电荷性质的差异进行分离纯化的一种层析技术，在纯化目的分子的同时，可去除内毒素和痕量杂质。

                                                                                                         阴离子交换层析Q Focurose HPR图谱

参考文献：

［1］Stadler J，Lemmens R，Nyhammar T．J.Gene Med，2004，6:S54－S66

关于我们

      武汉汇研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子层析介质研发、生产、销售于一体的高新技术企业。公司拥有大批高科技人才，在研发和创新能力方面投入了大量资金，拥有多项专利技术。通过独特的凝胶微球表面改性技术，我们能够生产凝胶、亲和、离子、疏水、多模式等五大类100多种生物大分子层析介质产品，广泛应用于疫苗、抗体、重组蛋白、基因治疗等领域。在层析介质的基础上，我们同时还提供特色的定制化填料开发服务和生物大分子纯化工艺开发服务。

      汇研生物目前已经成功实现了单条3000升琼脂糖（多糖）微球生产线的投产，单批次微球产量超过1000升，产量及质量位居国产层析填料行业前列。