干货分享 | 层析填料载量的测定及注意事项

       填料载量是填料性能中比较重要的一个参数，载量指填料可以结合目标产物的量，一般使用mg/mL或者g/L的单位表示，其中mg和g代表的是目标产物的量，mL和L代表的是填料的体积。

结合载量分为静态结合载量和动态结合载量，一般情况下动态结合载量小于静态结合载量；上样流速接近于零时，动态结合载量等于静态结合载量。

表1 结合载量的分类

     在实际的纯化实验中，基本都是采用柱层析方式，因此动态结合载量（DBC）是纯化实验中一个重要参数；填料出厂时会采用一些特定物质对填料载量进行测定，从而保证填料的批间一致性。对于同款填料不同的产品来说，动态结合载量存在着明显的不同；对于同种产品的不同款填料来说，动态结合载量也存在明显不同。因此针对固定产品，固定填料时，填料载量需要进行专门的测定，其他产品的载量数据仅可作为参考。根据实测的载量数据对于后期计算填料体积和层析柱规格有着重要意义。

     动态结合载量的高低直接决定了样品的上样量，使用过程中选择合适的填料载量可保证纯化效果的前提下提高填料的利用率，从而节约成本。

     层析的结合洗脱模式与流穿模式所采用的载量测定方式并不相同，在结合洗脱模式中，填料吸附目标产物，载量的测定物质一般选择目标产物；在流穿模式中，填料吸附杂质，载量测定物质一般选择有代表性的杂质。在实际操作中10%DBC（即上样流穿中目标产物浓度达到初始目标浓度的10%时的载量）可作为载量测定终点的依据。

载量测定前的注意事项

1、 柱子规格

     测试填料载量前需要装填合适柱高的层析柱，层析柱高度的差异会对载量测定结果产生影响，为了保证测定的准确性，柱高的选择应是实际实验或生产中经常使用的柱高范围，如生产要求柱高范围为15-25cm，测试载量的柱高可选取20cm左右。层析柱的直径直接决定了测试载量所需的样品量，一般选择直径较小的层析柱以便节省样品用量。

2、 柱效

    层析柱装填好后应对柱效进行测定，保证测试载量的层析柱是柱效合格的，从而使测定更加准确。

3、 样品

    用于测试载量的样品是具有代表性的样品，一般选择是质量较为稳定并测试结果对于后续纯化有指导意义的样品。

4、 死体积测定

   测定流速为1-5mL/min，使用纯化水冲洗上样管道至废液出口，待电导走平后，暂停机器，将上样管道放入0.8M NaCl中，继续冲洗，待电导上升时记录从暂停到电导上升时所用体积，该体积为系统死体积V死体积。

载量测定和最终操作载量的计算方法

  下面以arProtein A Focurose  HR亲和填料为例，介绍载量测定和最终操作载量的计算方法：

柱子规格：8mm×10cm & 5mL

样品：人IgG纯品 （使用平衡液稀释至10g/L）

保留时间：5min，对应体积流速为1mL/min

平衡液：20mM PB，150mM NaCl，pH7.4

10%流穿的判定：使用纯品进行DBC测定，测定上样样品初始浓度C初始，按照保留时间5min进行测试，持续上样，待UV开始升高时开始定体积收集，每0.5CV或1CV收集一管。测定每管对应的浓度，判定浓度达到10%C初始时对应的收集位置，按照图谱往前推算总上样体积V上样。

在完成上样操作后，进行淋洗-洗脱-再生-消毒-保存的操作。

上样体积的计算：

通过色谱图上的体积计算，该方法需保证上样过程中压力稳定没有气泡的干扰。

计算载量：

10%DBC载量=C初始*（V上样-V死体积-1/3V柱体积）/ 柱体积

其中：

 C初始：上样样品初始浓度

V上样：层析图中上样流穿浓度达到初始浓度10%时的上样体积

V死体积：层析系统死体积

V柱体积：层析柱体积

在大多数纯化中，不希望目标产物出现损失，因此针对10%DBC会有安全系数以保证层析步骤的收率，实际最大载量为80%×10%DBC载量；在进行放大生产时常使用实际最大载量进行操作。

10%DBC的载量测定方法广泛应用于亲和层析、离子层析、疏水层析和复合模式层析等。对于凝胶过滤层析来说，无需进行载量测定，上样量一般仅与体积相关，可按照填料使用说明控制相应的上样体积以便获得较好的分离性能。

关于我们

   武汉汇研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子层析介质研发、生产、销售于一体的高新技术企业。公司拥有大批高科技人才，在研发和创新能力方面投入了大量资金，拥有多项专利技术。通过独特的凝胶微球表面改性技术，我们能够生产凝胶、亲和、离子、疏水、多模式等五大类100多种生物大分子层析介质产品，广泛应用于疫苗、抗体、重组蛋白、基因治疗等领域。在层析介质的基础上，我们同时还提供特色的定制化填料开发服务和生物大分子纯化工艺开发服务。

   汇研生物目前已经成功实现了单条3000升琼脂糖（多糖）微球生产线的投产，单批次微球产量超过1000升，产量及质量位居国产层析填料行业前列。