干货分享 | 微球基质分子量的测定原理

  微球基质是层析填料的基础，良好的微球应具有如下性质：

1. 合适的粒径大小和形态，良好的粒径分布；

2. 较高的机械强度；

3. 良好的稳定性；

4. 拥有能和其他试剂发生化学反应的功能基团；

5. 较低的非特异性吸附；

6. 成本低，可再生。

分离介质的种类很多，按照骨架基质分类，有多糖类（如琼脂糖、纤维素、葡聚糖）、有机介质（如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺）和无机介质（如硅胶、玻璃珠、氧化物）。

我们生产的凝胶、亲和、离子、疏水、多模式等五大类100多种生物大分子层析介质，其微球就是多糖类基质。多糖类是最早被用作生化分离的材料，它们孔隙率较高，都拥有良好的亲水性和生物相容性，容易衍生化，在广泛的pH范围内使用稳定，容易再生，表面积大。

多糖类是高分子化合物， 高分子化合物之所以具有许多独特的性质，最重要的原因是分子量大。对于高分子的强度等物性，存在着一个临界分子量 M0，超过这个分子量时开始出现强度。当分子量超过 M0 时强度达到一定值。所以分子量的控制对于微球来说比较关键。

图1 分子量与强度的关系

高聚物除了分子量大，还具有多分散性， 即同一种聚合物，其分子量的大小各不相同。一般用平均分子量表征高聚物的分子量大小。根据统计方法不同，可分为：数均分子量Mn、重均分子量Mw、Z均分子量和粘均分子量。

分子量高的链条更加容易聚集成胶束，没有发生聚集的低分子链条则会留在网络中，再次加热时很容易离开网络。因此多糖类分子量会影响微球的孔隙率和孔径。了解多糖类的各种分子量及分子量分布，是了解多糖类性质的第一步，控制分子量也是合成微球的一个重要参数。

01

数均分子量Mn

其物理意义是各个不同分子量的分子所占的数量分数与其相对应的分子量乘积的总和。计算公式如下：

式中，Mi：单链分子量

         ni：具有相应分子量的链数目

         Xi：某一种分子量的分子数占总分子数的比例

简单来说，就是先取其中一种分子的分子量与乘以这种分子在总分子数中的占比，然后将所有分子量的分子都这么处理之后求和得到。

02

重均分子量Mw

其物理意义是各个不同分子量的分子所占的重量分数与其相对应的分子量乘积的总和，计算公式如下：

式中，Mi：单链分子量

         mi：具有相应分子量的链质量

         wi：具有某一种分子量的质量占总质量的比例

根据重均分子量和数均分子量的定义，我们可以发现，重均分子量Mw更强调分子量最高的部分对平均分子量做出的贡献，数均分子量Mn强调某一范围中分子数量最多的那部分对平均分子量做出的贡献。

03

多分散系数D

除了少数天然高分子如蛋白质、 DNA 等外，高分子化合物的分子量是不均一的，实际上是一系列同系物的混合物， 这种性质称为“多分散性” 。多分散性可以用多分散性系数D 来定量地表征， D=Mw/Mn，当分子量完全均一时D=1，分子量分布越宽，D值越大。

从重均分子量Mw、数均分子量Mn及多分散系数D的定义，我们可以看出，合成微球时，Mn、Mw及D都需要严格控制的。

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分子量的测定

分子量的测定用分子排阻色谱法。分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。大分子最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间tR较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间tR较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。因此保留时间tR与重均分子量Mw大小呈函数关系，方程如下：

 lgMw=a+btR（a、b均为常数）以凝胶色谱柱，采用排阻色谱法，可以得到高分子的色谱图，是一个色谱峰，实际是不同分子量正态分布图，如图2。

图2 高分子的流出色谱图

05

分子量分布

分子量分布是指根据分子量筛分或其他分离方法，把分子量分开，把复合物分解成不同分子量的组分的一种技术。总的来说，分子量分布是一种研究一种具有某种分子结构的物质中，分子量相互不同的组分的相对比例的一种技术。

图3 分子量分布曲线

图3中，横坐标为分子量，从小到大排列。纵坐标分为左右两边，左边代表信号每种分子量的信号强度，越高代表这个分子量的分子越多。右边代表累积分的结果，即图中那条从0%开始慢慢涨到100%的曲线，这条称为累积积分曲线，利用它可以直接在图中估计任意分子量区间的分子在总分子中的占比。

06

分子量计算与GPC统计软件

再通过一系列分子量标准物质和适宜的 GPC 软件（目前多数高效液相色谱品牌都有GPC软件插件供选择），可以计算出重均分子量Mw、数均分子量Mn、分子量分布和多分散系数D。从而对多糖做质量控制。

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武汉汇研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子层析介质研发、生产、销售于一体的高新技术企业。公司拥有大批高科技人才，在研发和创新能力方面投入了大量资金，拥有多项专利技术。