为确保产品的性能和无忧的操作,使用前请仔细阅读本手册,有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或当地的销售人员(联系方式见附录)。
1.产品介绍
Focurose 30 PG是一种凝胶过滤层析介质(也叫体积排阻色谱),适用于实验室和工业生产规模的生物分子精细纯化和缓冲液置换。
特点:
a.高耐压,流速快。
b.粒径小,分辩率高。
c.兼容性好,能耐受更苛刻的清洗条件。
表1:性能参数
基质 | 高度交联的琼脂糖和葡聚糖 |
粒径范围 | 25-45µm |
平均粒径 | 35±5µm |
分离范围 | ≤10kDa(球蛋白) |
pH稳定性 | 3-12(长期) 1-14(短期) |
耐压 | 0.3MPa |
推荐流速 | 30-50cm/h |
最大使用流速 | 90cm/h |
化学稳定性 | 所有常用溶液:8M尿素、6M盐酸胍、70%乙醇、1M 氢氧化钠 |
高压灭菌 | 121℃×30min(0.5M 氯化钠,pH 7.0) |
贮存条件 | 0.2M醋酸钠,20%乙醇 |
贮存温度 | 4-30℃ |
2.溶液制备
洗脱液:根据客户需求进行配制。
备注:建议在目标溶液中加入一定浓度的盐(至少0.025 M)用来抑制样本和介质的离子作用。
3.样品制备
3.1浓缩样品上样前过滤(平均粒径<45µm,用0.22µm过滤;45µm<平均粒径<165µm,用0.45µm过滤;平均粒径>165µm,用 0.8µm过滤)。
4.纯化流程(以装填XK 16/70的柱子为例 )
4.1清洗
取140g的沉降介质,加入3倍体积的纯化水重悬后用G3砂芯漏斗抽干,重复此步骤两次。
4.2匀浆
将清洗完的抽干的介质用相同体积(≈140ml)的纯化水进行重悬,用玻璃棒缓慢搅拌均匀。
4.3准备柱子
a.将柱管、下柱头、适配器以及装柱器用纯化水冲洗干净;
b.安装下柱头后拧紧密封圈;
c.注入3-5cm高的纯化水;
d.拧下下堵头,待排出所有气泡后再拧上下堵头;
e.安装装柱器,将层析柱垂直固定在层析系统附近。
4.4脱气
将匀浆后的介质用真空泵或超声清洗装置进行脱气。
4.5装柱
a. 将脱气后的介质用玻璃棒或其它搅拌装置温和搅拌均匀后,快速、连续加入(用玻璃棒引流,避免引入气 泡)到层析柱中。
b. 快速用纯化水将装柱器上端填满,并装上装柱器盖。
c. 用管路连接层析系统和装柱器后,拧下下堵头,以3ml/min(90cm/h)的流速压柱120min后暂停层析系统。
d. 拧上下堵头,快速取下装柱器,用纯化水填满柱管。
e. 将适配器连接层析系统,待管路中气泡排尽后,将适配器稍微倾斜后插入柱管至介质界面上端0.5-1cm,拧紧密封圈。
f. 拧下下堵头,以7ml/min(210cm/h)的流速压柱30min后停止层析系统。
g. 标记介质界面刻度,将适配器压至介质界面以下0.3cm。
4.6柱效检测
a. 连接层析柱出口至层析系统,用纯化水以1ml/min(30cm/h)的流速平衡2CV(柱体积);
b. 用定量环或上样泵注入1%CV的2%丙酮;
c. 以1ml/min(30cm/h)的流速运行1.5CV;
d. 计算HETP和As,HETP≤3h(h为平均粒径)且0.7≤As≤1.3方为合格,否则重装。
4.7使用
若柱效检测合格可立即使用,以1ml/min(30cm/min)的流速用平衡液(平衡液中加入0.15M氯化钠,抑制可能存在的非特异性吸附)平衡2CV后进行进样(建议上样体积≤2.5%CV)分离;若柱效检测合格后,以1ml/min(30cm/min)的流速用保存液平衡2CV后保存。
5.清洗(以装填XK 16/70的柱子为例 )
5.1 用纯化水以1ml/min(30cm/h)冲洗2个CV。
5.2 用0.5M NaOH以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
5.3 用纯化水以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
5.4 用0.5M 乙酸以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。。
5.5 用纯化水以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
5.6 用30%异丙醇以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
5.7 用纯化水以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
5.8 用0.2M醋酸钠、20%乙醇以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
6.消毒
6.1 用纯化水以1ml/min(30cm/h)冲洗2个CV。
6.2 用0.5M NaOH以1ml/min(30cm/h)的流速反向冲洗2个CV。
6.3 用纯化水以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
6.4 用0.2M醋酸钠、20%乙醇以1ml/min(30cm/h)的流速冲洗2个CV。
7.常见问题
表2:常见问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
目标峰与杂质峰分辨率差 | 1.上样体积过大 | 降低上样量至0.5%CV |
2.样品太粘稠 | 适当的稀释样品 | |
3.流速太快 | 降低流速 | |
4.柱子太短 | 选择更长或更细的柱子 | |
5.死体积过大 | 最小化管路和接头的死体积 | |
6.柱子装填不佳 | 重新装柱或使用预装柱 | |
7.样品没有过滤 | 用0.22um或0.45um过滤样品 | |
8.介质太脏 | 清洁柱子并重新平衡 | |
9.柱子没有垂直安装 | 重新装柱 | |
10.使用温度不均一 | 推荐维持恒定温度 | |
没有预期的洗脱峰 | 1.上样量和之前不一致 | 维持同样的上样量 |
2.蛋白和介质之间有离子作用 | 维持缓冲液中离子强度在0.05-0.15NaCl | |
3.蛋白和介质之间有疏水作用 | 降低离子强度可以最小化疏水作用,也可以通过调高pH、加入去污剂或有机试剂来降低疏水作用 | |
4.样品在储存的过程中发生改变 | 制备新鲜的样品 | |
5.蛋白和脂类在层析柱中沉淀 | 清洗柱子或更换新的柱子 | |
6.介质中有微生物生长 | 柱子使用过程中不会长菌,存放时必须用20%乙醇保存 | |
洗脱峰提前 | 1.装填的柱子中有间隙 | 重新装柱 |
2.蛋白形成二聚体或多聚体 | 注意维持样品在实验条件下的稳定性 | |
洗脱峰延迟 | 1.蛋白和介质之间有离子作用或疏水作用。 | 维持缓冲液中离子强度在0.05-0.15NaCl |
2.介质、滤膜、柱床顶部很脏 | 清洁柱子并重新平衡 | |
3.介质中有微生物生长 | 柱子使用过程中不会长菌,存放时必须用20%乙醇保存 | |
色谱峰上升缓慢 | 介质装填过紧 | 重新装柱 |
色谱峰拖尾 | 介质装填太松 | 重新装柱 |
柱床有裂缝或干涸 | 出现泄露或大体积气泡引入 | 检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱 |
液流较慢 | 1.蛋白或脂类聚集 | 及时清洗介质或滤膜 |
2.蛋白沉淀在介质中 | 调整洗脱液组分,以维持目标物的稳定性 | |
3.介质中微生物生长 | 柱子使用过程中不会长菌,存放时必须用20%乙醇保存 | |
4.柱床被压缩 | 重新装柱 | |
柱床中出现气泡 | 1.使用过程中出现温差或管路中有残留 | 重新装柱 |
压力升高 | 1.样品混浊 | 制备新鲜的样品 |
2.管路、筛板堵塞 | 清洗管路、筛板、介质,重新装柱 |
8.订购信息
表3:订购信息表
产品 | 规格 | 货号 |
Focurose 30 PG | 25ml | HN120208025M |
Focurose 30 PG | 100ml | HN120208100M |
Focurose 30 PG | 500ml | HN120208500M |
Focurose 30 PG | 1L | HN120208001L |
Focurose 30 PG | 5L | HN120208005L |
Focurose 30 PG | 20L | HN120208020L |
备注:大规格包装产品或其它产品购买,请咨询本公司当地销售或售前技术支持。
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