为确保产品的性能和无忧的操作,使用前请仔细阅读本手册,有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或当地的销售人员(联系方式见附录)。
1.产品介绍
Ni Focurose FF(IMAC)是利用Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化,适用于His标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。
特点:
a.快速、简单(一步纯化)。
b.使用范围广、操作简单,适合重力柱和预装柱(蠕动泵或者层析系统)。
c.多重选择,可以螯合各种金属离子进行使用(例如Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+等)。
d.相对于Ni Focurose FF(IDA)来说,Ni2+脱落低、试剂兼容性广(见表2)。
备注:当螯合Ca2+时,避免使用磷酸盐缓冲液(会形成沉淀)。
表1:Ni Focurose FF(IMAC)性能参数
基质 | 高度交联6%的琼脂糖 |
粒径范围 | 45-165µm |
平均粒径 | 90±5µm |
结合载量 | ≥40mg(His标签蛋白)/ml(介质) |
pH稳定性* | 3-12(长期) 2-14(短期) |
化学稳定性** | 所有常用水溶液和缓冲液 避免使用螯合剂(例如EDTA、EGTA)和还原剂(例如DTT和DTE) |
流速 | ≧300cm/h |
操作压力 | ≤0.3MPa |
贮存溶液 | 20%乙醇 |
贮存温度 | 4-30℃ |
*:此处稳定性指的是在未螯合金属离子时介质的稳定性。
表2:常用试剂兼容性
缓冲液 | 0.05M sodium phosphate, pH 7.4 0.1M Tris-HCl, pH 7.4 0.1M Tris-acetate, pH 7.4 0.1M HEPES, pH 7.4 0.1M MOPS, pH 7.4 0.1M sodium acetate, pH 4 |
变性剂 | 8M Urea 6M Gua-HCl |
去污剂 | 2% Triton X-100 2% Tween 20 2% NP-40 2% Cholate 1% CHAPS |
还原剂* | 0.005M DTE 0.005M DTT 0.02M β-mercaptoethanol 0.005M TCEP 0.01M reduced glutathione |
其它添加剂 | 0.5M Imidazole 20% Ethanol 50% Glycerol 0.1M Na2SO4 1.5M NaCl 0.001M EDTA** 0.06M Citrate |
2.溶液制备
平衡液:0.02M PB、0.5M NaCl、0.02-0.04M Imidazole,pH 7.4。
洗脱液:0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M Imidazole,pH 7.4。
备注:当纯化包涵体时,溶液中要添加8M Urea或6M Gua-HCl。
3.样品制备
3.1样品所在溶液要和平衡液保持一致,可以用平衡液进行裂解、透析/超滤/G25进行缓冲液置换。
3.2样品过滤(平均粒径<45µm,用0.22µm过滤;45µm<平均粒径<165µm,用0.45µm过滤;平均粒径>165µm,用 0.8µm过滤)。
4.纯化流程(以XK16/10为例)
采用液滴对液滴(避免引入气泡)的方式将柱子连接到层析系统上。
4.2 用纯化水以5ml/min的流速冲洗5个CV。
4.3 用洗脱液以5ml/min的流速冲洗5个CV。
4.4 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
4.5 将样品以5ml/min的流速上样。
4.6 用平衡液以5ml/min的流速冲洗至紫外吸收值平稳(10-15个CV)。
4.7 用洗脱液以5ml/min的流速洗脱5CV或20CV(阶梯式洗脱5CV/线性梯度洗脱20CV)。
5.再生(以XK16/10为例)
5.1用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.2用剥离液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.3 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.4 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.5 用0.1M NiSO4以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.6 用纯化水以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.7 用平衡液以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.8 用20%乙醇以5ml/min的流速冲洗5个CV。
备注:剥离液,0.02M PB、0.5M NaCl、0.05 EDTA,pH 7.4。
6 清洗(以XK16/10为例)
6.1 参照5.1-5.4操作将Ni2+剥离。
6.2 用1.5M NaCl以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.3 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.4 用1.0M NaOH以2.5ml/min的流速冲洗30个CV。
6.5 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.6 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.7 用30%异丙醇以2.5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.8 参照5.4-5.8操作将Ni2+螯合。
7 常见问题
表3:常见问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
纯化时目标物不与介质结合 或结合量较低 | 1.上样量过载 | 降低上样量 |
2.上样流速过快 | 降低上样流速 | |
3.蛋白或脂类在介质中聚集影响结合 | 及时有效地清洗介质或更换新的介质 | |
4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹,不能与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照,确定表达条件是否合适 | |
5.初始样品中没有组氨酸标签蛋白 | 通过基因序列或His标签抗体核实 | |
6.目标蛋白出现在流穿中 | 目标蛋白没有成功表达或样品与平衡液中pH及组分不正确 | |
洗脱时没有收集到目标物 或只收集到少量目标物 | 1.目标物没有与介质结合或结合量较少 | 先确认目标物是否与介质结合 |
2.洗脱条件不合适 | 加大洗脱液中咪唑浓度 | |
3.洗脱时间不够 | 降低流速,延长洗脱液的保留时间 | |
4.洗脱体积过小 | 加大洗脱体积 | |
5.洗杂时,目的蛋白被洗下来 | 降低洗杂液中的咪唑浓度 | |
6.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀 | 检测目标物在洗脱液条件(pH和盐浓度)下的溶解度和稳定性。可以尝试在洗脱液中加入一些添加剂:如0.2% Triton X-100或0.5% Tween 20 | |
目标物纯度较低
| 1.样品没有经过前处理 | 样品上柱前必须要经过离心或过滤 |
2.样品粘度过高 | 用平衡液适当的稀释样品,降低粘度。 | |
3.洗杂不彻底 | 加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致 | |
4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀 | 及时有效地清洗介质 | |
5.杂质与Ni2+具有较高的亲和力。 | 用其它类型介质进行纯化(如离子或分子筛) | |
6.目标物出现降解 | 检测目标物的稳定性并加入蛋白酶抑制剂 | |
7.柱料装填效果不佳 | 重新装填或购买 | |
8.杂质与介质出现非特异性吸附 | 适当选择添加剂降低非特异性吸附,可以尝试在样品中加入一些添加剂:如0.5%Triton X-100、1.0% Tween 20或50%甘油 | |
9.分离柱顶部有较大储样体积 | 重新装柱或降低储样体积 | |
10.介质中有微生物生长 | 介质使用完后,请及时正确保存介质 | |
介质载量下降 | 1.上样流速过快 | 降低上样流速 |
2.蛋白或脂类在介质中聚集,导致载量下降。 | 及时清洗介质 | |
3.使用次数过多 | 更换新介质 | |
4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹,不能较好与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照,确定表达条件是否合适 | |
色谱峰上升过陡 | 介质装填过紧 | 重新装柱 |
色谱峰上升过缓或拖尾 | 介质装填太松 | 重新装柱 |
柱床有裂缝或干涸 | 出现泄露或大体积气泡引入 | 检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱 |
液流较慢 | 1.蛋白或脂类聚集 | 及时清洗介质或滤膜 |
2.蛋白沉淀在介质中 | 调整平衡液和洗脱液组分,以维持目标物的稳定性和介质的结合效率 | |
3.分离柱中微生物生长 | 所用试剂必须经过过滤和脱气; 样品上柱前必须离心或过滤 |
8 订购信息
表4:订购信息表
产品 | 规格 | 货号 |
Ni Focurose FF(IMAC) | 25ml | HQ060312025M |
Ni Focurose FF(IMAC) | 100ml | HQ060312100M |
Ni Focurose FF(IMAC) | 500ml | HQ060312500M |
Ni Focurose FF(IMAC) | 1L | HQ060312001L |
Ni Focurose FF(IMAC) | 5L | HQ060312005L |
Ni Focurose FF(IMAC) | 20L | HQ060312020L |
备注:大规格包装产品或其它产品购买,请咨询本公司当地销售或售前技术支持。
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