为确保产品的性能和无忧的操作，使用前请仔细阅读本手册，有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或当地的销售人员（联系方式见附录）。
1.产品介绍
Ni Focurose FF（IMAC）是利用Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化，适用于His标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。
特点：
a.快速、简单（一步纯化）。
b.使用范围广、操作简单，适合重力柱和预装柱（蠕动泵或者层析系统）。
c.多重选择，可以螯合各种金属离子进行使用（例如Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+等）。
d.相对于Ni Focurose FF(IDA)来说，Ni2+脱落低、试剂兼容性广（见表2）。
备注：当螯合Ca2+时，避免使用磷酸盐缓冲液（会形成沉淀）。
表1：Ni Focurose FF（IMAC）性能参数
基质 | 高度交联6%的琼脂糖 |
粒径范围 | 45-165µm |
平均粒径 | 90±5µm |
结合载量 | ≥40mg(His标签蛋白)/ml(介质) |
pH稳定性* | 3-12(长期) 2-14(短期) |
化学稳定性** | 所有常用水溶液和缓冲液 避免使用螯合剂（例如EDTA、EGTA）和还原剂（例如DTT和DTE） |
流速 | ≧300cm/h |
操作压力 | ≤0.3MPa |
贮存溶液 | 20%乙醇 |
贮存温度 | 4-30℃ |
*：此处稳定性指的是在未螯合金属离子时介质的稳定性。
表2：常用试剂兼容性
缓冲液 | 0.05M sodium phosphate, pH 7.4 0.1M Tris-HCl, pH 7.4 0.1M Tris-acetate, pH 7.4 0.1M HEPES, pH 7.4 0.1M MOPS, pH 7.4 0.1M sodium acetate, pH 4 |
变性剂 | 8M Urea 6M Gua-HCl |
去污剂 | 2% Triton X-100 2% Tween 20 2% NP-40 2% Cholate 1% CHAPS |
还原剂* | 0.005M DTE 0.005M DTT 0.02M β-mercaptoethanol 0.005M TCEP 0.01M reduced glutathione |
其它添加剂 | 0.5M Imidazole 20% Ethanol 50% Glycerol 0.1M Na2SO4 1.5M NaCl 0.001M EDTA** 0.06M Citrate |
2.溶液制备
平衡液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.02-0.04M Imidazole，pH 7.4。
洗脱液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M Imidazole，pH 7.4。
备注：当纯化包涵体时，溶液中要添加8M Urea或6M Gua-HCl。
3.样品制备
3.1样品所在溶液要和平衡液保持一致，可以用平衡液进行裂解、透析/超滤/G25进行缓冲液置换。
3.2样品过滤（平均粒径<45µm，用0.22µm过滤；45µm<平均粒径<165µm，用0.45µm过滤；平均粒径>165µm，用 0.8µm过滤）。
4.纯化流程（以XK16/10为例）
采用液滴对液滴（避免引入气泡）的方式将柱子连接到层析系统上。
4.2 用纯化水以5ml/min的流速冲洗5个CV。
4.3 用洗脱液以5ml/min的流速冲洗5个CV。
4.4 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
4.5 将样品以5ml/min的流速上样。
4.6 用平衡液以5ml/min的流速冲洗至紫外吸收值平稳（10-15个CV）。
4.7 用洗脱液以5ml/min的流速洗脱5CV或20CV(阶梯式洗脱5CV/线性梯度洗脱20CV)。
5.再生（以XK16/10为例）
5.1用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.2用剥离液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.3 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.4 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
5.5 用0.1M NiSO4以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.6 用纯化水以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.7 用平衡液以5ml/min的流速冲洗5个CV。
5.8 用20%乙醇以5ml/min的流速冲洗5个CV。
备注：剥离液，0.02M PB、0.5M NaCl、0.05 EDTA，pH 7.4。
6 清洗（以XK16/10为例）
6.1 参照5.1-5.4操作将Ni2+剥离。
6.2 用1.5M NaCl以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.3 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.4 用1.0M NaOH以2.5ml/min的流速冲洗30个CV。
6.5 用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.6 用纯化水以5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.7 用30%异丙醇以2.5ml/min的流速冲洗10个CV。
6.8 参照5.4-5.8操作将Ni2+螯合。
7 常见问题
表3：常见问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
纯化时目标物不与介质结合 或结合量较低 | 1.上样量过载 | 降低上样量 |
2.上样流速过快 | 降低上样流速 | |
3.蛋白或脂类在介质中聚集影响结合 | 及时有效地清洗介质或更换新的介质 | |
4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹，不能与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照，确定表达条件是否合适 | |
5.初始样品中没有组氨酸标签蛋白 | 通过基因序列或His标签抗体核实 | |
6.目标蛋白出现在流穿中 | 目标蛋白没有成功表达或样品与平衡液中pH及组分不正确 | |
洗脱时没有收集到目标物 或只收集到少量目标物 | 1.目标物没有与介质结合或结合量较少 | 先确认目标物是否与介质结合 |
2.洗脱条件不合适 | 加大洗脱液中咪唑浓度 | |
3.洗脱时间不够 | 降低流速，延长洗脱液的保留时间 | |
4.洗脱体积过小 | 加大洗脱体积 | |
5.洗杂时，目的蛋白被洗下来 | 降低洗杂液中的咪唑浓度 | |
6.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀 | 检测目标物在洗脱液条件（pH和盐浓度）下的溶解度和稳定性。可以尝试在洗脱液中加入一些添加剂：如0.2% Triton X-100或0.5% Tween 20 | |
目标物纯度较低
| 1.样品没有经过前处理 | 样品上柱前必须要经过离心或过滤 |
2.样品粘度过高 | 用平衡液适当的稀释样品，降低粘度。 | |
3.洗杂不彻底 | 加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致 | |
4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀 | 及时有效地清洗介质 | |
5.杂质与Ni2+具有较高的亲和力。 | 用其它类型介质进行纯化（如离子或分子筛） | |
6.目标物出现降解 | 检测目标物的稳定性并加入蛋白酶抑制剂 | |
7.柱料装填效果不佳 | 重新装填或购买 | |
8.杂质与介质出现非特异性吸附 | 适当选择添加剂降低非特异性吸附,可以尝试在样品中加入一些添加剂：如0.5%Triton X-100、1.0% Tween 20或50%甘油 | |
9.分离柱顶部有较大储样体积 | 重新装柱或降低储样体积 | |
10.介质中有微生物生长 | 介质使用完后，请及时正确保存介质 | |
介质载量下降 | 1.上样流速过快 | 降低上样流速 |
2.蛋白或脂类在介质中聚集，导致载量下降。 | 及时清洗介质 | |
3.使用次数过多 | 更换新介质 | |
4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹，不能较好与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照，确定表达条件是否合适 | |
色谱峰上升过陡 | 介质装填过紧 | 重新装柱 |
色谱峰上升过缓或拖尾 | 介质装填太松 | 重新装柱 |
柱床有裂缝或干涸 | 出现泄露或大体积气泡引入 | 检查管路是否有泄露或气泡，重新装柱 |
液流较慢 | 1.蛋白或脂类聚集 | 及时清洗介质或滤膜 |
2.蛋白沉淀在介质中 | 调整平衡液和洗脱液组分，以维持目标物的稳定性和介质的结合效率 | |
3.分离柱中微生物生长 | 所用试剂必须经过过滤和脱气； 样品上柱前必须离心或过滤 |
8 订购信息
表4：订购信息表
产品 | 规格 | 货号 |
Ni Focurose FF（IMAC） | 25ml | HQ060312025M |
Ni Focurose FF（IMAC） | 100ml | HQ060312100M |
Ni Focurose FF（IMAC） | 500ml | HQ060312500M |
Ni Focurose FF（IMAC） | 1L | HQ060312001L |
Ni Focurose FF（IMAC） | 5L | HQ060312005L |
Ni Focurose FF（IMAC） | 20L | HQ060312020L |
备注：大规格包装产品或其它产品购买，请咨询本公司当地销售或售前技术支持。
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