为确保产品的性能和无忧的操作,使用前请仔细阅读本手册,有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或当地的销售人员(联系方式见附录)。
1.产品介绍
GST Focurose 4FF适用于分离纯化GST标签蛋白、谷胱甘肽S-转移酶或谷胱甘肽依赖性蛋白。
特点:
a.快速、简单(一步纯化)。
b.载量高、流速快、易于放大。
c.温和的洗脱条件可以完整的保留蛋白的生物学活性。
表1:介质性能参数
基质 | 高度交联4%的琼脂糖 |
粒径范围 | 45-165µm |
平均粒径 | 90±5µm |
结合载量 | >10mg(GST标签蛋白)/ml(介质) |
pH稳定性 | 3-12 |
化学稳定性 | 所有常用水溶液,如:1M醋酸盐,pH 4.0、0.1M NaOH、70%乙醇、8M尿素、6M 盐酸胍。 |
流速 | ≧250cm/h |
操作压力 | ≤0.3MPa |
贮存溶液 | 20%乙醇 |
贮存温度 | 4-30℃ |
2.溶液制备
平衡液:0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2PO4,pH 7.3。
洗脱液:0.05M Tris-HCl、0.01M GSH,pH 8.0
3.样品制备
3.1样品所在溶液要和平衡液保持一致,可以用平衡液进行裂解、透析/超滤/G25进行缓冲液置换。
3.2样品过滤(平均粒径<45µm,用0.22µm过滤;45µm<平均粒径<165µm,用0.45µm过滤;平均粒径>165µm,用 0.8µm过滤)。
4.纯化流程(以XK16/10为例)
4.1采用液滴对液滴(避免引入气泡)的方式将柱子连接到层析系统上。
4.2用纯化水以5ml/min的流速冲洗5个CV。
4.3用平衡液以5ml/min的流速冲洗10个CV。
4.4将样品以1ml/min的流速上样。
4.5用平衡液以5ml/min的流速冲洗至紫外吸收值平稳(10-15个CV)。
4.6用洗脱液以5ml/min的流速洗脱10CV。
5.放大
保持柱床高度不变
5.2 保持线性流速不变
备注:若实际情况和实验室数据有偏差,可以维持停留时间不变。
6.清洗
清洗后可以去除一些强结合性物质(例如一些强结合的蛋白、变性蛋白、脂类等),从而达到恢复介质的优良性能(例如载量、流动性、柱效等)。
建议每使用5次后进行一次清洗,具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。
6.1 用5CV 1.0%Triton X-100或70%乙醇冲洗后,立即用10CV纯化水冲洗。
备注:用于去除疏水结合物质。
6.2 用5CV 8M尿素或6M盐酸胍冲洗后,立即用10CV纯化水冲洗。
备注:用于去除聚集在介质中的沉淀或变性物质。
6.3 用10CV的20%乙醇冲洗后保存。
备注:20%乙醇可以防止微生物的生长,20%乙醇保存的介质可以在4-30℃(4-8℃更佳)保存。
7.常见问题
表2:常见问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
纯化时目标物不与介质结合 或结合量较低 | 1.上样量过载 | 降低上样量 |
2.上样流速过快 | 降低上样流速 | |
3.蛋白或脂类在介质中聚集 | 及时有效地清洗介质或更换新的介质 | |
4.样品在超声裂解过程中失活 | 采用较为温和的条件进行超声裂解 | |
5.样本或平衡液中pH不在正确的范围 | 保证样本和平衡液pH在6.5-8.0以内 | |
6.表达条件过于剧烈,目标物构象发生改变,不能与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照 | |
7.目标物质发生聚集 | 在裂解前加入1-10mM DTT | |
洗脱时没有收集到目标物 或只收集到少量目标物 | 1.目标物没有与介质结合或结合量较少 | 先确认目标物是否与介质结合 |
2.洗脱条件不合适 | 加大GSH浓度到20-40mM,并保证洗脱液pH在8.0-9.0以内 | |
3.洗脱时间不够 | 降低流速,延长洗脱液的保留时间 | |
4.洗脱体积过小 | 加大洗脱体积 | |
5.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀 | 检测目标物在洗脱液条件(pH)下的溶解度和稳定性。可以尝试在洗脱液中加入一些添加剂:如0.1%Triton X-100或2%N-octyl glucoside | |
目标物纯度较低
| 1.样品没有经过前处理 | 样品上柱前必须要经过离心或过滤 |
2.样品粘度过高 | 用平衡液适当的稀释样品,降低粘度。 | |
3.洗杂不彻底 | 加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致 | |
4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀 | 及时有效地清洗介质 | |
5.洗脱条件不佳,洗脱流速太快、梯度太陡。 | 优化洗脱条件 | |
6.目标物出现降解 | 检测目标物的稳定性 | |
7.柱料装填效果不佳 | 重新装填或购买 | |
8.杂质出现非特异性吸附 | 适当选择添加剂降低非特异性吸附 | |
9.分离柱顶部有较大储样体积 | 重新装柱或降低储样体积 | |
10.介质中有微生物生长 | 介质使用完后,请及时正确保存介质 | |
介质载量下降 | 1.上样流速过快 | 降低上样流速 |
2.蛋白或脂类在介质中聚集,导致载量下降。 | 及时清洗介质 | |
3.使用次数过多,配基被氧化或脱落 | 及时清洗介质或更换新介质 | |
4.样品在超声裂解或表达时构象改变,不能较好的与配基结合 | 采用温和的裂解方式或表达条件 | |
色谱峰上升过陡 | 介质装填过紧 | 重新装柱 |
色谱峰上升过缓或拖尾 | 介质装填太松 | 重新装柱 |
柱床有裂缝或干涸 | 出现泄露或大体积气泡引入 | 检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱 |
液流较慢 | 1.蛋白或脂类聚集 | 及时清洗介质或滤膜 |
2.蛋白沉淀在介质中 | 调整平衡液和洗脱液组分,以维持目标物的稳定性和介质的结合效率 | |
3.分离柱中微生物生长 | 所用试剂必须经过过滤和脱气; 样品上柱前必须离心或过滤 |
8.订购信息
表3:订购信息表
产品 | 规格 | 货号 |
GST Focurose 4FF | 25ml | HQ030307025M |
GST Focurose 4FF | 100ml | HQ030307100M |
GST Focurose 4FF | 500ml | HQ030307500M |
GST Focurose 4FF | 1L | HQ030307001L |
GST Focurose 4FF | 5L | HQ030307005L |
GST Focurose 4FF | 20L | HQ030307020L |
备注:大规格包装产品或其它产品购买,请咨询本公司当地销售或售前技术支持。
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